FICHAMENTO 7 QUESTÃO 3

Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes à imunoglobulina

ARDOZO, Daniela Maira et al. Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes à imunoglobulina. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. [online]. 2009, vol.42, n.6, pp. 651-656. ISSN 0037-8682.

“Muitos testes genéticos envolvidos em estudos de doenças humanas necessitam da utilização do DNA genômico extraído de amostras de sangue. Normalmente, o DNA genômico é obtido a partir da separação da camada de células brancas (buffy-coat) ou do sangue total.” (p.651)

“Frequentemente, ensaios genéticos envolvendo a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a extração de DNA, utilizam amostras de sangue coletadas com anticoagulantes.” (p.651)

“Muitos métodos para o isolamento de DNA de amostras coaguladas foram descritos e alguns deles enfocam a obtenção de um DNA satisfatório para a PCR. Outras técnicas se preocupam com amostras de DNA de alta qualidade, porém são procedimentos demorados e bastante trabalhosos, envolvendo processos de homogeneização do coágulo.” (p.652)

“...uma técnica rápida e eficiente de extração de DNA de sangue coagulado se faz necessária, uma vez que materiais biológicos que podem ser utilizados para muitos estudos genéticos são descartados rotineiramente. Além disso, esta metodologia pode representar mais uma opção para a extração de DNA de amostras cujo anticoagulante foi ineficaz.” (p.652)

“Este projeto foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Estadual de Maringá, estando de acordo com a Resolução 196/96 – CNS.” (p.652)

“As amostras extraídas pelo método EZ-DNA não se mostraram satisfatórias, uma vez que para a dissolução do botão de células, em solução, houve a necessidade de muitos dias de incubação em banho-maria (7 dias), levando assim à degradação do DNA, (dados não mostrados), além do dispendioso tempo necessário para a extração.” (p.653)

“Independente da comparação, o método de extração de DNA por EZ-DNA não foi adequado quando o material biológico de origem foi o coágulo sanguíneo. As amostras de DNA obtidas não amplificaram por nenhuma das duas metodologias de PCR testadas e o procedimento foi demorado, uma vez que foi necessário um período de 5 a 7 dias, em banho-maria, a 56ºC, para a dissolução do botão de células nucleadas na solução de EZ, o que pode ter contribuído para a degradação do DNA.” (p.655)

“...pode-se concluir que a técnica de salting out é muito eficiente, simples e rápida para ser utilizada na extração de DNA de amostras de sangue humano coagulado por qualquer Laboratório de Biologia Molecular. Além disso, o DNA apresentou excelente qualidade e concentração adequada para amplificar os loci HLA e KIR pelas técnicas de biologia molecular PCR-SSO-Luminex e PCR-SSP made in house, respectivamente.” (p.655)